Confronto tra tecnologie alternative di purificazione mAb

Di Jack Vicalvi, scienziato principale, J2 Biopharm Associates LLC

Negli ultimi 15 anni abbiamo assistito a più miglioramenti nello sviluppo dei processi a valle rispetto ai 35 anni precedenti. Questa è la prima di una panoramica in due parti di prodotti innovativi selezionati e approcci con implicazioni universali che hanno contribuito a miglioramenti consentendo la produzione di terapie biologiche con grandi molecole, come anticorpi monoclonali (mAb) e vettori virali, con recuperi e purezza più elevati.

Nella Parte 1 esaminiamo come questi prodotti cambiano il modo in cui produciamo i mAb, dove possono essere utilizzati negli attuali schemi di sviluppo dei processi e quali vantaggi conferiscono rispetto ai metodi precedenti. Toccheremo l'economia situazionale che guida l'uso di questi prodotti o approcci innovativi. Infine, ci concentreremo sui modelli di scalabilità GMP per scopi pratici: se non si scala, non importa quanto possa essere buono.

Diagrammi di flusso del processo mAb

La chiarificazione del raccolto del bioreattore è il primo passo nel processo a valle; non è l'ultimo passaggio del processo a monte poiché è essenzialmente una purificazione della sostanza farmaceutica. Questo passaggio è fondamentale per un'efficiente purificazione del prodotto di interesse; la filtrazione di dimensioni semplici del materiale raccolto è il metodo tradizionale utilizzato. Tuttavia, a seconda degli attributi critici di qualità (CQA) richiesti, la sola filtrazione basata sulle dimensioni potrebbe non essere più adeguata o inevitabile.

L'uso di dispositivi di filtraggio carichi (come i filtri 3M SP e ZB o le membrane Millipore DOHC, COHC e XOHC) può comportare la rimozione anticipata di contaminanti altamente carichi, come il DNA della cellula ospite (hcDNA) e alcune proteine ​​della cellula ospite (HCP) e virus, migliorando significativamente l’efficienza di cattura a valle e, quindi, il recupero iniziale e la purezza. In situazioni in cui la vitalità cellulare è bassa (<50%) durante la raccolta, si verifica un marcato aumento dei detriti della cellula ospite, inclusi DNA, HCP (inclusi gli enzimi proteolitici) e particelle virali intracellulari o endogene dove può verificarsi un'ulteriore riduzione tramite filtrazione su membrana carica. diventare significativi durante le successive fasi di purificazione. In situazioni che comportano una bassa vitalità cellulare, l'aggiunta di un'endonucleasi, preferibilmente nel bioreattore, per 1 ora prima della raccolta servirebbe a ridurre la lunghezza del filamento di DNA e a migliorare significativamente la filtrabilità. L'endonucleasi continua a funzionare durante la chiarificazione fino alla cattura (solitamente da 3 a 8 ore, a seconda delle condizioni di cattura e della velocità di caricamento).

Nella maggior parte dei casi, i mAb non si legano alle matrici anioniche; tuttavia, potrebbe essere necessario regolare il pH e/o la conduttività del raccolto (di nuovo, preferibilmente nel bioreattore), a seconda del bersaglio di interesse, per impedire il legame al filtro o per preparare il bersaglio per la cattura nelle fasi successive. Le condizioni per il recupero ottimale del prodotto con la massima riduzione dei contaminanti dovranno essere determinate empiricamente per ciascun mAb.

Quando vengono selezionati filtri di profondità di dimensioni adeguate, la centrifugazione diventa nella migliore delle ipotesi ridondante; poi c'è il problema dello scale-up e dei problemi di convalida della pulizia, anche con i secchi usa e getta (costi di investimento e manutenzione, generazione di aerosol e smaltimento dei secchi usati). Nei casi in cui la filtrazione non è praticabile, l'uso della cromatografia a letto espanso potrebbe essere un'opzione più fattibile ed economica (vedere la tecnologia Rhobust EBA di Upfront).

Tipicamente, la fase di cattura impiegherà una resina di proteina A. Tuttavia, non tutte le porzioni di proteina A sono uguali. Alcuni legano diversi mAb con vari gradi di specificità e avidità; pertanto, qualsiasi resina proteica A scelta deve essere determinata empiricamente. Inoltre, c’è da considerare la matrice resinosa; queste includono resine morbide come l'agarosio e alcuni metacrilati e le resine rigide come il polistirolo o la ceramica. Tutti dispongono di ampi fascicoli normativi.

Le differenze principali tra le resine morbide e rigide risiedono nella velocità lineare e nel consumo del tampone durante il funzionamento. L'agarosio è una resina morbida che richiede supporto a parete o che il letto cede, formando un "sorriso" che produce un bordo anteriore durante l'eluizione in colonne più larghe di 5 cm. Inoltre è un mezzo a diffusione lenta e perde capacità e integrità del letto al di sopra di 300 cm/ora. Inoltre, a causa della sua natura diffusiva, richiede un lavaggio approfondito durante i cambi del tampone, soprattutto prima dell'eluizione. Le resine Capto sono agarosio reticolato, che può alleviare alcuni di questi problemi; tuttavia, la matrice di base è ancora agarosio e richiede lavaggi estesi e velocità di flusso lente per consentire la diffusione. Le resine rigide sono più facili da imballare, richiedono molto meno lavaggio e mantengono l'integrità del letto senza supporto a parete. Queste resine possono anche essere fatte funzionare a velocità lineari da 800 a 1.200 cm/ora senza significativa perdita di produttività.