Nature Communications volume 14, numero articolo: 4407 (2023) Citare questo articolo
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Il danno renale acuto (AKI) è un importante fattore di rischio per la malattia renale cronica (CKD), ma i meccanismi alla base della mancata riparazione dei tubuli e della transizione AKI-CKD non sono completamente compresi. In questo studio, abbiamo mirato al monitoraggio dinamico della lesione e del rimodellamento dei tubuli per comprendere se la lesione focale in seguito all'AKI possa diffondersi nel tempo. Qui presentiamo un modello di AKI, in cui abbiamo reso ischemico solo la metà del rene. Utilizzando la microscopia intravitale seriale a 2 fotoni e l'identificazione genetica delle cellule ciclistiche, abbiamo monitorato il rimodellamento dinamico dei tessuti nelle regioni renali post-e non ischemiche simultaneamente e per 3 settimane. L'analisi spaziale e temporale delle cellule ciclistiche rispetto alla morte iniziale delle cellule necrotiche ha dimostrato una pronunciata propagazione ed espansione della lesione nelle regioni del tessuto non necrotico, che prevedeva l'atrofia dei tubuli con espressione epiteliale di VCAM1. In sintesi, le nostre analisi longitudinali sulla lesione, sul rimodellamento e sul destino dei tubuli forniscono importanti spunti sulla patologia dell’AKI.
Il danno renale acuto (AKI) è definito come un improvviso declino della funzionalità renale, spesso causato da una lesione acuta dei tubuli1. A seconda della gravità dell’insulto, la funzionalità renale nei pazienti può recuperare. Tuttavia, è ormai accertato che i pazienti con AKI mantengono un rischio elevato di sviluppare successivamente una malattia renale cronica (CKD)2,3. I meccanismi di questa transizione AKI-IRC non sono completamente compresi3 ma sono associati a disfunzione delle cellule endoteliali4,5, reclutamento e infiammazione delle cellule immunitarie interstiziali6,7,8, fibrosi interstiziale renale9,10 e riparazione incompleta dell'epitelio tubulare11,12. Il tubulo prossimale renale (PT) è il principale sito di lesione durante il danno da ischemia-riperfusione (IRI) e subisce un significativo rimodellamento13. Dopo la lesione, le cellule PT possono dedifferenziarsi con espressione de novo di marcatori come Kim-1, Cd44 e vimentina, proliferare ed eventualmente ri-differenziarsi in cellule PT funzionali14,15,16. Tuttavia, nel loro stato dedifferenziato, si impegnano anche in vie di segnalazione paracrine che migliorano l'infiammazione interstiziale, il reclutamento dei miofibroblasti e il successivo rimodellamento fibrotico14,17,18,19. Recenti studi di sequenziamento di singole cellule ottenuti da reni IRI hanno inoltre suggerito che un sottogruppo di queste cellule PT indifferenziate subisce uno stato di riparazione fallita con aumento della segnalazione infiammatoria8,11. Infine, la morte delle cellule necrotiche indotta dall'AKI può comportare direttamente un aumento dell'infiammazione dei tessuti e la promozione di ulteriori lesioni20,21.
Per prevenire la transizione AKI-IRC, abbiamo bisogno di una migliore comprensione di come il danno tissutale e i processi di rimodellamento si collegano al successo o al fallimento del recupero. Tuttavia, ci sono dati longitudinali limitati per studiare questo. Le biopsie dei pazienti con AKI non vengono raccolte di routine e dimostrano una notevole eterogeneità rispetto al momento in cui sono state effettuate22. Inoltre, gli studi sull’AKI sugli animali prevedono classicamente il prelievo di organi per ulteriori analisi ex vivo. Pertanto, i processi di rimodellamento indotti dall'AKI altamente dinamici vengono ricostruiti da singole istantanee acquisite da diversi animali e punti temporali. Ciò limita le conoscenze sulle interazioni dinamiche cellula-cellula e sul loro impatto sul destino dei nefroni. In effetti, diverse domande piuttosto basilari su come il tessuto renale possa rigenerarsi dopo un danno sono ancora senza risposta o discusse in modo controverso: quali cellule proliferano in risposta al danno tissutale? Quanto è grande la capacità di recupero del tessuto renale danneggiato? Come viene influenzato il tessuto renale illeso da una lesione focale adiacente? Le lesioni possono diffondersi nel tempo?
In questo studio, abbiamo combinato la microscopia intravitale seriale a 2 fotoni (2PM) con l'identificazione genetica delle cellule ciclistiche23 e un modello di danno da ischemia-riperfusione parziale (IRI parziale), che è stato concettualizzato per studiare gli effetti delle cellule necrotiche sul tessuto adiacente illeso. L'imaging seriale di reni con IRI parziale nell'arco di 3 settimane ha fornito dati accoppiati di danno e rimodellamento dei tubuli e, per la prima volta, ha collegato la morte iniziale delle cellule necrotiche ai siti locali di proliferazione dei tubuli e infine al destino dei tubuli. Pertanto, i nostri dati hanno identificato il tubulo prossimale precoce come un sito chiave di lesione necrotica e fonte di formazione di getti granulari, che era associato alla propagazione della lesione a valle e allo sviluppo dell'atrofia tubulare.
25 μm) from any propidium iodide (PI)+ cell detected on day 0 (n = 145, 184 and 37 segments from 4 mice for PT-S1, PT-S2, and DCT/CD, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: two-sided paired t-test with p < 0.05 considered significant (Supplementary Extended Statistics.k). d Same dataset as in (c) displayed to reveal distinct locations of proliferating tubule cells in different tubule segments over days after partial IRI (n = 4 partial IRI mice; detailed information on segment number/group provided in Supplementary Table 3); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.m). e Volumetric quantification of tubular GFP expression (% of total nuclei/ segment) clustered by necrotic thresholds (n = 223, 140, 157 PT-S1 segments and 250, 237, 103 PT-S2 segments for non-necrotic, moderate, and severe, respectively, from 6 mice); mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.n). f Linear regression of PI+ nuclei (% of total nuclei/segment) at day 0 and cumulative GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) from days 1, 2, and 3 for PT-S1 and PT-S2 segments (n = 144 and 180 from 4 mice). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI), R2 and Pearson’s coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significance test across groups, p-values from two-sided test. */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>20% necrotic cells at day 0). Consistent with the findings above, we observed significantly higher GFP expression in non-necrotic and moderately necrotic PT-S2 segments on days 2 and 3 as compared to respective PT-S1 (Fig. 4e). Among severely necrotic segments, PT-S1 segments proliferated more than PT-S2 segments on day 1. However, GFP expression in severely necrotic PT-S2 segments rapidly increased from day 2 and exceeded that observed in PT-S1 segments on days 3 and 7 (Fig. 4e). Finally, we aimed to evaluate if PT-S1 and PT-S2 displayed different capacities to proliferate upon necrotic cell death of a given degree. Thus, we performed a linear regression of PI-positive nuclei (% of total nuclei) observed on day 0 and the cumulative number of GFP-positive nuclei (% of total nuclei) observed on days 1 to 3 after partial IRI. For both PT-S1 and PT-S2 segments, a significant correlation between the initial number of necrotic cells and the subsequent proliferative response was detected (Fig. 4f). Of note, there was no significant difference in the slopes of the linear regressions, indicating a comparable necrosis-induced proliferative response in PT-S1 and PT-S2 segments (Fig. 4f). However, we detected a significantly higher intercept in the linear regression of PT-S2 segments (Fig. 4f), which demonstrated a population of PT-S2 segments that proliferated in absence of preceding necrotic injury. In contrast, the intercept of the PT-S1 linear regression equation was not statistically different from zero, confirming that proliferation in these segments strictly depended on the presence of initial necrotic injury./p>1% PI+ necrotic cells at day 0 was classified as necrotic; mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test, no adjustment for multiple comparisons (Supplementary Extended Statistics.o). e Linear regression of luminal granular cast area (% of total segment cross-sectional area) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment, assessed in 3D) measured 24 h later in the same segment and proliferating outside a 25 µm radius from any PI+ nucleus (n = 179 and 184 for non-necrotic and necrotic segments from 4 and 3 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI); R2 and Pearson’s correlation coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significant difference between the segment types, p-values from two-sided test, */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>1% PI+) (c) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) at day 3/4 (d), in recovered and atrophic tubule segments, respectively (c: n = 89 and 92 segments from 4 and 3 mice; d: n = 124 and 168 segments from 4 mice, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical tests: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.q). e Correlative in vivo and ex vivo 2-photon microscopy images of CycB1-GFP kidneys 21 days after partial IRI reveal selective tubular VCAM-1 immunostaining (blue, arrows) in atrophic tubules (ω). Scale bar: 100 µm. f, g Tubular fate distribution (%) across partial IRI areas (f: n = 82,232, and 153 segments for Not-IR, Mid, and IR from 4, 6, and 5 mice, respectively), and days after partial-IRI (g: n = 103 and 106 for recovered and atrophic tubules from 6 mice, respectively). h Binary regression of luminal granular cast area (in % of total segment cross-sectional area) at day 3/4 and respective tubule fate (0 = non-atrophy; 1 = atrophy), (n = 237 segments from 4 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept); R2, and effect size as odds ratio (OR) for the predictor are reported. *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001./p>1% of total nuclei) that regained morphologically intact epithelium. Atrophic segments were defined by a collapsed tubular lumen and severely fragmented epithelial appearance (Supplementary Fig. 2). (9) Dynamic PT-S1 function was assessed as albumin reuptake capacity expressed as the mean fluorescent intensity ratio of Alexa594-albumin in the apical cytoplasmic region of PT-S1 segments and in peritubular capillaries (n = 170)./p>
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