La restrizione conformazionale modella l'inibizione di una proteina adattatrice dell'efflusso multifarmaco

Nature Communications volume 14, numero articolo: 3900 (2023) Citare questo articolo

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Le pompe di efflusso a membrana svolgono un ruolo importante nella resistenza batterica multifarmaco. Il sistema di pompa di efflusso multifarmaco tripartito di Escherichia coli, AcrAB-TolC, è un bersaglio per l'inibizione per ridurre lo sviluppo di resistenza e ripristinare l'efficacia dell'antibiotico, con omologhi in altri patogeni ESKAPE. Qui, razionalizziamo un meccanismo di inibizione contro la proteina adattatrice periplasmatica, AcrA, utilizzando una combinazione di spettrometria di massa a scambio di idrogeno/deuterio, analisi di efflusso cellulare e simulazioni di dinamica molecolare. Definiamo la dinamica strutturale di AcrA e scopriamo che un inibitore può infliggere una stabilizzazione a lungo raggio in tutti e quattro i suoi domini, mentre un substrato di efflusso interagente ha un effetto minimo. I nostri risultati supportano un modello in cui un inibitore forma un cuneo molecolare all'interno di una fessura tra i domini lipoilici e αβ di AcrA, diminuendo la sua trasmissione conformazionale dei segnali evocati dai farmaci da AcrB a TolC. Questo lavoro fornisce approfondimenti molecolari sulla funzione della proteina adattatrice multifarmaco che potrebbero essere preziosi per lo sviluppo di terapie antimicrobiche.

La resistenza multifarmaco si riferisce alla capacità dei batteri patogeni di sopravvivere a dosi letali di molti composti strutturalmente diversi1. La multiresistenza batterica continua a diffondersi a ritmi allarmanti, minacciando la salute umana a livello globale. Nel 2019, la multiresistenza batterica ha causato direttamente 1,27 milioni di decessi in tutto il mondo, una cifra superiore a quella dell’HIV e della malaria messi insieme2.

Uno dei principali meccanismi di resistenza multifarmaco è l'attività delle pompe di efflusso3,4. Le pompe di efflusso sono comunemente sovraespresse in risposta all'esposizione agli antibiotici e possono esportare un'ampia gamma di composti chimicamente diversi, riducendo la concentrazione intracellulare di antibiotici e conferendo resistenza ai farmaci1. La famiglia di trasportatori della nodulazione e divisione cellulare della resistenza idrofobica e anfifila (HAE-RND) svolge un ruolo chiave nella resistenza batterica multifarmaco. Escherichia coli AcrAB-TolC è il membro prototipo di questa famiglia con omologhi in altri batteri ESKAPE gram-negativi5,6,7. Si tratta di un complesso proteico tripartito che si estende sull'involucro della membrana dei batteri gram-negativi, dove AcrB è il trasportatore di membrana interno del complesso, AcrA la proteina adattatrice periplasmatica (PAP) della famiglia di proteine ​​Membrane Fusion Protein (MFP) e TolC il canale della membrana esterna (Fig. 1a). Energizzato dalla forza motrice del protone, AcrB trasporta i substrati, inclusi gli antibiotici, dall'ambiente intracellulare all'esterno della cellula, attraverso un canale sigillato formato da AcrA e TolC (Fig. 1a)8,9.

uno schema del complesso AcrAB-TolC incorporato nell'involucro cellulare. Lipopolisaccaride LPS. b Struttura di AcrA isolata dall'intero complesso AcrAB-TolC (PDB:5O66)23. c Tre costrutti di AcrA. AcrAL contiene Cys25 che viene lipidato dopo la scissione del peptide segnale 1-24. AcrAS contiene una mutazione Cys25Met e quindi manca della lipidazione e del peptide segnale. AcrASD contiene due sequenze AcrAS collegate da un linker TRRIT. d Caratterizzazione MS nativa dei costrutti AcrA a pH 6,0. Il tampone proteico è stato scambiato con tampone di acetato di ammonio 100 mM prima della MS. AcrAL richiedeva la presenza di una concentrazione micellare critica (CMC) 2× di DDM allo 0,03%. AcrAL si presenta come un mix di monomeri e dimeri, AcrAS come monomeri e AcrASD come dimero. Gli spettri raccolti su repliche biologiche e da due diversi sistemi MS nativi, un tempo di volo e un sistema orbitrap, forniscono la certezza che queste firme spettrali non sono artefatti della preparazione delle proteine ​​o del rilevamento MS67. Le buste contrassegnate da un asterisco (*) rappresentano lo stato di carica più elevato indicativo di disordine intrinseco. Masse trovate nella tabella supplementare 1.

Sono stati compiuti sforzi per sviluppare inibitori della pompa di efflusso (EPI) contro questi sistemi per "ravvivare" le attività di vari antibiotici preesistenti, ai quali una popolazione batterica è diventata resistente10. Fino ad ora, l’obiettivo è stato quello di generare EPI mirati allo stesso trasportatore AcrB. Tuttavia, gli EPI precedentemente identificati non sono riusciti a passare agli studi clinici, a causa di problemi di tossicità e della natura promiscua di AcrB nel trasportare i suoi inibitori11,12. Pertanto, è necessario esplorare altre strade nel tentativo di generare EPI di successo, con AcrA che emerge come potenziale bersaglio per l'inibizione10,13. Recentemente, NSC 60339 è stato identificato come un inibitore di AcrA attraverso uno screening congiunto sperimentale-computazionale10. Lavori precedenti suggerivano che NSC 60339 potesse causare un cambiamento conformazionale in AcrA e proponevano un possibile sito di legame all'interfaccia tra i domini del barile lipoilico e αβ, chiamato sito IV (Fig. 1b)10,14. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che AcrA ha funzioni più diverse, essendo identificato come un "necrosegnale" batterico all'interno degli sciami di E. coli15: quando una sottopopolazione dello sciame muore, le cellule morte rilasciano il necrosegnale AcrA, che lega TolC all'esterno delle altre cellule. cellule vive, stimolando l'efflusso all'interno dell'area interessata e la sovraregolazione di varie pompe di efflusso16. È interessante notare che lavori recenti hanno anche dimostrato che NSC 60339 può inibire la capacità di necrosegnalazione mediata da AcrA16. Comprendere i meccanismi molecolari dell'inibizione di AcrA è quindi importante per la futura scoperta di farmaci EPI e di necrosegnalazione. Tuttavia, un meccanismo di inibizione di AcrA rimane sfuggente.