Ottimizzazione della filtrazione del flusso tangenziale

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La filtrazione a flusso tangenziale (TFF) è un metodo utile per separare molecole o particelle in una soluzione liquida in base alle dimensioni e consente sia la concentrazione che la possibilità di modificare la composizione del tampone.1 Il TFF viene utilizzato in quasi tutti i processi a valle della produzione biofarmaceutica per fornire una concentrazione delicata e rapida e diafiltrazione: un processo di diluizione in cui i componenti vengono rimossi o separati. In confronto, la cromatografia con filtrazione su gel separa le molecole in base alle dimensioni e offre la possibilità di modificare la composizione del tampone, ma questa tecnica non può concentrare l'entità target.

Nella filtrazione a flusso normale (NFF) i solidi spesso formano una torta o un secondo strato sopra la membrana. Quando si processano biomolecole o particelle più piccole, spesso è sufficiente anche un secondo strato sottile sulla membrana per sporcarla, riducendo o interrompendo il processo di filtrazione.

"La pressione e il flusso sono i parametri chiave da controllare e monitorare", afferma Fredrik Lundström, senior product manager di Cytiva. "Si consiglia vivamente di monitorare la pressione su tutti e tre i flussi: alimentazione, retentato e permeato."

L'area della membrana del filtro deve essere utilizzata nel modo più efficiente possibile e il processo ottimizzato per funzionare a un flusso elevato (flusso permeato/area della membrana) che non sporchi la membrana. "Esiste un equilibrio tra l'applicazione di una pressione transmembrana (TMP) sufficiente per ottenere un flusso elevato, ma non così elevato da provocare l'imbrattamento della membrana", afferma Lundström.

Per evitare incrostazioni nelle operazioni di microfiltrazione, in cui i pori del filtro sono grandi, è fondamentale controllare e limitare il flusso del permeato (flusso). Nell'ultrafiltrazione, dove i pori sono piccoli, è importante che il TMP non sia troppo alto.

Secondo Lundström, se il processo include la diafiltrazione e lo scambio di buffer, è importante ottimizzare il punto di partenza della diafiltrazione, ovvero la quantità di prodotto target da concentrare, per ridurre al minimo l'uso del buffer e il tempo di filtrazione. Un tampone di diafiltrazione alimentato continuamente al contenitore di ricircolo TFF è più efficiente e consente di risparmiare tempo e tampone.

"È importante monitorare il peso del tampone e i contenitori del prodotto per determinare il fattore di concentrazione - quante volte il prodotto è stato concentrato - e il fattore di diafiltrazione - il numero di scambi del tampone di diafiltrazione a cui il prodotto è stato esposto", raccomanda Lundström.

Il TFF è una classica operazione di biotrattamento per la raccolta, la chiarificazione e la concentrazione finale con scambio di buffer. Il TFF viene utilizzato anche per nuove modalità come vettori virali o applicazioni di mRNA. In queste applicazioni, la tecnica di filtrazione è più diffusa nelle prime fasi del processo rispetto alla tradizionale lavorazione dei mAb.

Esistono due tipi comuni di dispositivi TFF: cassette e fibre cave. Le cassette vengono comunemente applicate per la concentrazione di mAb poiché forniscono un flusso più elevato e le fibre cave sono utili quando l'entità target è sensibile al taglio. “Ciò ha reso le fibre cave più interessanti con la maggiore necessità di processare cellule e virus sensibili al taglio come i lentivirus”, ha affermato Lundström.

La tecnica TFF può anche essere implementata come coltivazione continua (perfusione), sia in produzione che in un bioreattore N-1, dove può fornire controlli aggiuntivi rispetto alla filtrazione a flusso tangenziale alternato (ATF).

Quando le cassette filtranti TFF vengono posizionate in serie, è possibile la concentrazione con un singolo passaggio di liquido sulla membrana TFF anziché più volte. “In questo caso, poiché il TFF a passaggio singolo non richiede un’operazione di tipo batch, ha suscitato molto interesse nell’area della lavorazione continua”, afferma Lundström.

I sistemi TFF ciclici doppi2 in cui una pompa peristaltica alimenta il flusso attraverso due membrane con dimensioni dei pori di 200 e 30 nm sono considerati un'opzione migliore per isolare vescicole extracellulari nell'intervallo di dimensioni da 30 a 200 nm, rispetto alla filtrazione diretta o al singolo TFF ciclico. La combinazione dello scambio di tampone con il TFF a doppio ciclo aiuta ulteriormente a eliminare i contaminanti.

“Innanzitutto considerare il tipo di applicazione e quale sia l’obiettivo dell’operazione unitaria, come il fattore di concentrazione, lo scambio di buffer, l’entità target e la composizione del liquido. Questo può darti un’indicazione sul tipo di dispositivo TFF e sulla dimensione dei pori della membrana con cui dovresti iniziare”, afferma Lundström. "Quindi puoi iniziare a selezionare filtri diversi."