Studi di fattibilità dell'endoscopia multimodale non lineare utilizzando fasci di fibre multicore per la scansione remota da sezioni di tessuto a organi sfusi

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 13779 (2023) Citare questo articolo

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Qui riportiamo lo sviluppo e l'applicazione di una sonda in fibra ottica multi-core compatta per l'imaging multimodale non lineare, che combina le modalità label-free di scattering Raman anti-Stokes coerente, seconda generazione armonica e fluorescenza eccitata a due fotoni. Le sonde con questo design in fibra multi-core evitano parti mobili e che trasportano tensione all'estremità distale, fornendo così una promettente migliore compatibilità con i requisiti clinici rispetto alle implementazioni concorrenti. Le caratteristiche prestazionali della sonda vengono stabilite utilizzando criosezioni sottili e bersagli artificiali prima di valutarne l'applicabilità a campioni clinicamente rilevanti utilizzando tessuti intestinali umani e suini sfusi ex vivo. Dopo la ricostruzione dell'immagine per contrastare la natura intrinsecamente pixelata dei dati, le immagini registrate mostrano un'elevata qualità dell'immagine e conformità morfochimica a livello tissutale rispetto alle immagini multimodali non lineari ottenute con un microscopio a scansione laser utilizzando un obiettivo microscopico standard. Inoltre, viene presentata e dimostrata una procedura di ricostruzione semplice ma efficace che produce risultati soddisfacenti. Infine, viene delineato un percorso chiaro per ulteriori sviluppi per facilitare la traduzione della sonda in fibra multimodale nella valutazione e nell'applicazione clinica nel mondo reale.

L'imaging in vivo senza etichetta dei tessuti che fornisce informazioni sia morfologiche che chimiche è cruciale per molte applicazioni mediche previste, in particolare per un esame istopatologico intraoperatorio non invasivo dei tessuti. Negli ultimi anni è stato dimostrato che la combinazione di diverse tecniche spettroscopiche in un approccio di imaging multimodale è utile per soddisfare tutti i requisiti di velocità, profondità di penetrazione e specificità molecolare1,2,3. Uno di questi approcci è la microscopia Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), che cogenera simultaneamente gli altri due effetti non lineari, la fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) e la generazione di seconda armonica (SHG), in un unico dispositivo di imaging. CARS consente di mappare una vibrazione molecolare specifica, dove quelle scelte più frequentemente indicano prevalentemente lipidi (ad esempio, ~ 2855 cm−1, νs(CH2)) o proteine (ad esempio, ~ 2930, νs(CH3)), entrambi i quali sono abbondanti nei campioni biologici. Al contrario, il TPEF può essere utilizzato per affrontare gli autofluorofori endogeni, in particolare il NAD(P)H, che è onnipresente nei tessuti a causa della sua importanza per il metabolismo cellulare. Inoltre, SHG è un processo che si verifica solo in materiali non centrosimmetrici, rendendolo altamente specifico per biomateriali quasi cristallini come fibre di collagene o filamenti di miosina. Pertanto, la combinazione di queste tre modalità non lineari fornisce preziose informazioni sulla morfochimica di un tessuto senza alcuna etichetta.

In questo contesto, abbiamo dimostrato che la microscopia multimodale non lineare che combina CARS, SHG e TPEF consente il rilevamento di strutture caratteristiche e i cambiamenti molecolari associati a malattie diffuse, in particolare il cancro4,5. Per facilitare l'interpretazione dei dati immagine CARS/SHG/TPEF, algoritmi avanzati di elaborazione delle immagini possono estrarre automaticamente le proprietà caratteristiche6,7. Inoltre, oltre alla valutazione automatica, si potrebbe dimostrare che le informazioni codificate in queste immagini multimodali registrate senza etichetta possono anche essere tradotte in immagini computazionali di ematossilina ed eosina (H&E)8 mediante statistiche multivariate, che non solo attingono al corpo esistente di conoscenza e formazione dei professionisti medici, ma potrebbe anche aiutare l’accettazione transitoria. Per generare tali immagini H&E computazionali e/o fornire una valutazione automatizzata di dati di imaging non lineare multimodale, tra cui la classificazione della malattia o la segmentazione visiva come base per ulteriori decisioni cliniche, in loco e direttamente durante l'intervento chirurgico, dispositivi endoscopici portatili compatti sono necessarie. Con scenari applicativi che vanno dal rilevamento dei margini tumorali nelle ferite chirurgiche all'indagine dei sintomi e al rilevamento, classificazione e monitoraggio della malattia negli organi cavi (ad esempio la malattia infiammatoria della cavità orale9), lo sviluppo di dispositivi endoscopici per l'imaging spettroscopico non lineare è stato oggetto di notevole interesse per molti anni. Sono stati presentati diversi approcci: oltre alle sonde a scansione puntiforme10, i più comuni sono la scansione di endoscopi a fibra11,12,13,14,15,16,17,18 e l'utilizzo di specchi a scansione galvanica o scanner per sistemi microelettromeccanici (MEMS)19,20,21, 22,23,24.

90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>

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