Rilevazione di RNA virali a temperatura ambiente tramite proteine ​​reporter prodotte attraverso il target

Nature Biomedical Engineering (2023) Citare questo articolo

9956 accessi

32 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

I test sugli acidi nucleici non sono generalmente utilizzabili negli ambienti di cura perché richiedono apparecchiature costose e sofisticate per il controllo della temperatura di reazione e per il rilevamento del segnale. Qui riportiamo un test senza strumenti per il rilevamento accurato e multiplex degli acidi nucleici a temperatura ambiente. Il test, che abbiamo chiamato INSPECTR (per reazione di traduzione della cassetta di espressione con accoppiamento stecca interno), sfrutta la legatura splintata specifica del bersaglio delle sonde di DNA per generare cassette di espressione che possono essere progettate in modo flessibile per la sintesi senza cellule di proteine ​​reporter, con reporter enzimatici che consentono un intervallo di rilevamento lineare che copre quattro ordini di grandezza e reporter peptidici (che possono essere mappati su target univoci) che consentono un rilevamento visivo altamente multiplexato. Abbiamo utilizzato INSPECTR per rilevare un pannello di cinque bersagli virali respiratori in un'unica reazione tramite una lettura del flusso laterale e circa 4.000 copie di RNA virale tramite un'ulteriore amplificazione del cerchio rotante a temperatura ambiente della cassetta di espressione. Sfruttare la biologia sintetica per semplificare i flussi di lavoro per la diagnostica degli acidi nucleici può facilitarne una più ampia applicabilità presso il punto di cura.

L’attuale pandemia di COVID-19 sottolinea l’urgente necessità di tecnologie diagnostiche nuove e innovative per consentire il rilevamento a basso costo degli agenti patogeni presso il punto di cura e di necessità1. I test antigenici rapidi dominano i test su richiesta in tutto il mondo grazie alla loro facilità d'uso, al basso costo e alla conservazione a temperatura ambiente2. Tuttavia, l’identificazione degli anticorpi antigene-specifici necessari per la produzione di tali test è impegnativa e richiede molto tempo, limitando la capacità dei test antigenici di multiplexare o distinguere ceppi e varianti di agenti patogeni. I test molecolari che rilevano gli acidi nucleici virali o batterici sono preferibili ai test antigenici rapidi per i loro cicli di sviluppo più rapidi, una migliore discriminazione delle varianti, sensibilità più elevate e limiti di rilevamento (LoD) superiori3. Tuttavia, il gold standard per tali analisi, la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), richiede una strumentazione sofisticata per controllare i cicli di temperatura e rilevare l'amplificazione di sequenze target specifiche ed è difficile da implementare nel momento in cui è necessario4. Un metodo di analisi e rilevamento senza strumenti potrebbe migliorare notevolmente l’accessibilità dei test molecolari sensibili ai consumatori, in particolare a coloro che non hanno accesso a laboratori di test centralizzati5.

I precisi requisiti di riscaldamento ciclico della qPCR sono stati affrontati mediante strategie di amplificazione isotermica degli acidi nucleici, come l'amplificazione mediata da loop (LAMP)6, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA)7,8 e la reazione di amplificazione dell'enzima intaccante (NEAR)9. Molte di queste strategie accoppiano l'amplificazione a una fase di rilevamento che impiega sonde fluorescenti (come RPA) o fari molecolari (come NEAR) per fornire un ulteriore livello di specificità. Altri metodi, come SHERLOCK o DETECTR, sfruttano la tecnologia CRISPR per rilevare l'amplificazione tramite il rilascio di un fluoroforo spento utilizzando l'attività collaterale delle nucleasi programmabili Cas12 o Cas13 (rif. 10,11,12,13,14,15,16, 17). Tuttavia, queste strategie isotermiche richiedono ancora strumenti: riscaldatori portatili per raggiungere e mantenere la temperatura ottimale per l'attività enzimatica durante l'amplificazione esponenziale e fotometri per misurare la fluorescenza. Inoltre, tali tecniche di amplificazione isotermica hanno una capacità limitata di multiplexing a causa delle sfide nella progettazione dei primer e della sovrapposizione degli spettri di emissione dei reporter fluorescenti.

Al contrario, le strategie di biologia sintetica consentono il rilevamento degli acidi nucleici con letture più flessibili basate sulle proteine. L'espressione genica può essere controllata utilizzando un riboregolatore sequenza-specifico, come un interruttore di punta, in modo tale che solo la sequenza di RNA bersaglio (o "trigger") trasduca un segnale per attivare la produzione di una proteina reporter18. Poiché questi reporter possono essere fluorescenti, colorimetrici o luminescenti, sono possibili diverse modalità di rilevamento. Gli interruttori d'appoggio, in particolare, sono stati utilizzati per la diagnostica molecolare in vitro in contesti con risorse limitate19. Le sequenze target derivate dai patogeni vengono aggiunte direttamente a una reazione di espressione priva di cellule (CFE) liofilizzata20, spesso dopo la pre-amplificazione, consentendo il rilevamento stabile e sensibile di Ebola20, Zika21, norovirus22, C. difficile23, HIV24 e SARS -Sequenze CoV-2 (rif. 25). Sebbene queste reazioni di espressione senza cellule possano essere eseguite in condizioni prossime a quelle ambientali, la preamplificazione richiesta spesso significa che è ancora necessaria l'attrezzatura.